تهیه کونژوگه پلی ساکارید PRP هموفیلوس آنفلوآنزا تیپ b با اگزوتوکسین A سودوموناس آئروژینوزا و سنجش ایمنی زایی آن در مدل حیوانی

            هموفیلوس آنفولانزا

میکروبیولوژی

دسته‌بندی سویه های هموفیلوس آنفلوآنزا قابل تیپ بندی

کلون سازی و تهاجم

کلون‌سازی در مجرای تنفسی فوقانی

حمله به اپیتلیوم

حمله به جریان خون

بقا در جریان خون

حمله به CNS

شاخص‌های بیماری زایی هموفیلوس آنفولانزا

OMPs

پیلی

ایمونوگلوبولین A پروتئاز

لیپوپلی ساکارید (LPS)

نقش LPS در بیماری‌زایی

کپسول

دخالت کپسول در بیماری‌زایی

ژنتیک بیان کپسول

 روشها و آزمونهای تشخیص آزمایشگاهی

روشهای تشخیص کلاسیک

معایب تشخیص کلاسیک

برتری روشهای تشخیص مولکولی

اپیدمیولوژی

پیشگیری

درمان

واکسن های کونژوگه

واکسن‌های Hib

پاسخ های واکسن کونژوگه

پاسخ های واکسن پلی‌ساکاریدی

عوامل دخیل در ایمونوژنسیتی واکسن های کونژوگه پلی ساکاریدی – پروتئینی

طول زنجیره پلی ساکاریدی

نوع اتصال

مولکول های حامل

EDC یا EDAC

کونژوگاسیون به روش آمیداسیون

تهیه کونژوگه ایمونوژن هاپتن – حامل

پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیک

ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه

سنجش فعالیت باکتری کشی

فصل سوم مواد و روش ها

مواد و وسایل لازم

تهیه میکروارگانیسم های به کار گرفته شده در این مطالعه

باز کردن سویه باکتری همو فیلوس آنفولانزای تیپ b لیوفیلیزه و کشت آن

فرآوردن و تخلیص PRP

تهیه بذر محیط کشت

تیمار عصاره مخمر

آماده کردن فرمانتور و تلقیح بذر

نمونه گیری از فرمانتور

مرحله رسوب دهی الکلی

مرحله الکل زنی

مرحله شست و شو با کلریدمنیزیم

تیمار با ستاولن

افزودن فسفات سدیم

مرحله الکل زنی مجدد

تیمار با هیدروکسیل آپاتیت

فیلتراسیون سوپرناتانت

لیوفلیزاسیون

تعیین خلوص PRP تخلیص شده

تست ریبوز

اساس تست بیال

معرف‌های تست بیال

محلولها و ترکیبات

تهیه‌ی محلول‌های استاندارد ریبوز

آماده سازی PRP تخلیص شده

آزمون های پروتئین سنجی

روش برادفورد

روش پروتئین سنجی  Lowry

آزمون ایمونو ژل دیفیوژن

سنجش نوکلئیک اسید

تخلیص اگزوتوسین A سودوموناس آئروژینوزا PA

طرز باز کردن سوش لیوفیلیزه جدید

تهیه لوله بذر

اطمینان از خالص بودن سوش

تست سوش برای تولید اگزوتوکسین A

تهیه محیط کشت

رسوب با استات روی  مولار

رسوب با سولفات آمونیوم

دیالیز اگزوتوکسین   A

کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل اگزوتوکسین  A

مواد مورد نیاز:

سنجش تولید اگزوتوکسین  A

سنجش توکسیسیتی

دتوکسیفای کردن اگزوتوکسین A  به روش فرمآلدیئد

ژل فیلتراسیون جهت تخلیص کونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb  (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا

آزمون های کنترل و کیفی کونژوگه

سنجش پروتئین

تعیین میزان اسید نوکلئیک

کنترل توکسیسیته غیرعادی((Abnormal toxicity

آزمون پیروژنی

ایمیونیزاسیون خرگوشها و خونگیری

تهیه بافر باربیتال :

تهیه محلول کوماسی بلو و رنگ بر :

پلی آکریل آمید ژل الکتروفورز درحضور سدیم دو دسیل سولفات(SDSPAGE)

اصول روش SDSPAGE

محلول¬های مورد نیاز

تهیه ژل پایین SDSPAGE

تهیه ژل بالا با SDSPAGE

رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید

محلول¬های مورد نیاز

روش رنگ آمیزی

آزمون بررسی فعالیت باکتریسیدالی سرم حیوان ایمیون (SBA )

اصول آزمون SBA

مواد مورد نیاز برای آزمون SBA Serum Bactericidal Assay))

روش انجام آزمون

فصل چهارم: نتایج

کشت سویه باکتری

شرایط کشت در فرمانتور

تعیین خلوص PRP

اندازه‌گیری میزان ریبوز

کنترل میزان پروتئین در پلی ساکارید PRP و  ETA و  PRP ETA

کنترل میزان اسید نوکلئیک در پلی ساکارید PRP و   PRP ETA

کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسینA سودوموناس آئروژینوزا

بازده کونژوگاسیون PRPETA

کنترل پیروژنی

کنترل توکسیسیتی غیر عادی در موش سوری

آزمون ایمونوژل دیفیوژن

الکتروفورز (SDSPAGE) برای بررسی وزن مولکولی

ارزیابی فعالیت باکتری کشی سرم حیوان واکسینه شده

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

واکسن‌های کونژوگه‌ی (Hboc) PRPCRM

واکسن کونژوگه‌ی PRPTT

واکسن کونژوگه‌ی PRPOMP

تولید کپسول هموفیلوس آنفولانزای تیپ b(PRP)

کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسین A

سرم باکتریسیدال اسی

نتیجه گیری

پیشنهادات