جداسازی و شناسایی باکتری ترشح کننده لیپاز خارج سلولی و مقاوم به حلال آلی و کاربرد آن در تولید بیودیزل

فصل اول

مقدمه

۱-۱- آنزیم های مقاوم به حلال های آلی

۱-۲- لیپازها

۱-۳-منابع آنزیم لیپاز

۱-۳-۱- لیپازهای گیاهی

۱-۳-۲-لیپازهای جانوری

۱-۳-۳- لیپازهای میکروبی

۱-۴- طبقه بندی لیپازها

۱-۵- ساختار لیپازها

۱-۵-۱- ساختار لیپازها و مقاومت آن ها به حلال های آلی

۱-۶- مکانیسم عمل لیپازها

۱-۷- انواع واکنش های لیپازی

۱-۸- واکنش در حلال های آلی

۱-۹- باکتری های مقاوم به حلال های آلی:

۱-۱۰- کاربردهای صنعتی لیپازها و لیپازهای مقاوم به حلال آلی

۱-۱۱- سوخت های زیستی

۱-۱۰-۱-اتانول زیستی

۱-۱۰-۲- گاز زیستی

۱-۱۰-۳- سوخت سبز

۱-۱۰-۴- زیست دیزل یا بیودیزل

۱-۱۰-۴-۱- روش های تولید بیودیزل:

۱-۱۰-۴-۲- کاتالیزورهای واکنش ترانس استریفیکاسیون

۱-۱۰-۴-۲-۱- کاتالیزورهای قلیایی

۱-۱۰-۴-۲-۲- کاتالیزورهای اسیدی

۱-۱۰-۴-۲-۳- آنزیم ها (لیپازها) به عنوان کاتالیزورهای واکنش ترانس استریفیکاسیون

۱-۱۰-۴-۲-۴ – مزایا و محدودیت های استفاده از آنزیم ها (لیپازها) به عنوان

کاتالیزور به جای اسید و قلیا

فصل دوم مروری بر پژوهش های پیشین

اهداف پژوهش

فرضیه

فصل سوم ابزار ، مواد و روش ها

۳-۱- ابزار و دستگاه ها

۳-۲- مواد شیمیایی و آزمایشگاهی

۳-۳- نرم افزارها

۳-۴- روش ها

۳-۴-۱- نمونه برداری

۳-۴-۱-۱- تهیه ی نمونه ها

۳-۴-۱-۲- آماده سازی نمونه ها

۳-۴-۲- محیط های کشت باکتری

۳-۴-۲-۱- محیط کشت جامد جهت جداسازی تک کلونی ها

۳-۴-۲-۲- شناسایی و جداسازی کلونی های باکتریایی

۳-۴-۳- محیط کشت افتراقی جهت جداسازی باکتری های مقاوم به حلال آلی

۳-۴-۴- جداسازی باکتری های ترشح کننده لیپاز خارج سلولی

۳-۴-۴-۱-محیط جامد تریبوتیرین آگار

۳-۴-۴-۲- محیط جامد Tween

۳-۴-۴-۳- محیط جامد ردامین B- آگار

۳-۴-۵- محیط ترشح آنزیم لیپاز خارج سلولی

۳-۴-۶- تعیین خصوصیات مورفولوژیکی سویه IE-93

۳-۴-۶-۱- رنگ آمیزی گرم

۳-۴-۷-۲- واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)

۳-۴-۷-۳- الکتروفورز محصول حاصل از PCR

۳-۴-۷-۴- خالص سازی محصول PCR از ژل آگارز

۳-۴-۷-۵ – استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیک برای تجزیه  و تحلیل توالی به دست آمده

۳-۴-۸- سنجش فعالیت آنزیم لیپاز

۳-۴-۸-۱- سنجش فعالیت آنزیمی به روش رنگ سنجی

۳-۴-۸-۱-۱- استفاده از سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (PNPP)

۳-۴-۸-۱-۲- استفاده ازسوبسترای پارانیتروفنیل بوتیرات (PNPB)

۳-۴-۸-۲- سنجش فعالیت آنزیمی به روش Cuppric reagent

۳-۴-۱۰- تخلیص آنزیم لیپاز

۳-۴-۱۰-۱- جمع آوری آنزیم خام

۳-۴-۱۰-۲- آماده سازی فرایند دیالیز

۳-۴-۱۰-۳- ستون Q-Sepharose

۳-۴-۱۰-۳-۱- بازیافت و بهبود رزین

۳-۴-۱۰-۳-۲- روش استفاده از ستون Q-Sepharose برای تخلیص

۳-۴-۱۰-۴-ستون Sephacryl S-200

۳-۴-۱۰-۴-۱-بازیافت و بهبود رزین

۳-۴-۱۰-۴-۲- روش استفاده از ستون Sephacryl S-200

۳-۴-۱۱- سنجش کمی پروتئین به روش برادفورد

۳-۴-۱۱- بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم لیپاز سویه IE-93

۳-۴-۱۱-۱- بررسی نیمرخ دمایی

۳-۴-۱۱-۲- بررسی نیمرخ pH

۳-۴-۱۱-۳- بررسی پایداری آنزیم در دماهای مختلف

۳-۴-۱۱-۴- بررسی پایداری آنزیم در pH های مختلف

۳-۴-۱۱-۵- بررسی اثر یون های فلزی بر فعالیت آنزیمی

۳-۴-۱۱-۶- بررسی اثر حلال های آلی:

فصل چهارم نتایج

۴-۱- نمونه برداری

۴-۲- جداسازی باکتری ها بر اساس مشخصات کلونی ها برروی محیط جامد

۴-۳- جداسازی باکتری های مقاوم به حلال آلی

۴-۴- غربال گری باکتری های ترشح کننده لیپاز خارج سلولی

۴-۵-شناسایی باکتری

۴-۵-۱- خصوصیات مورفولوژیکی سویه IE-93

۴-۵-۲- خصوصیات فیلوژنتیکی سویه IE-93

۴-۵-۲-۱- استخراج DNA

۴-۵-۲-۲- واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) ، تکثیر ۱۶S rRNA و تعیین توالی

۴-۵-۲-۳- تجزیه و تحلیل توالی به دست آمده وموقعیت فیلوژنی  باکتری

stenotrophomonas sp.strain IE93در بین سایر باکتری ها.

۴-۶- محیط ترشح آنزیم لیپاز

۴-۷- تخلیص آنزیم لیپاز

۴-۸- تعیین خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم

۴-۸-۱- بررسی پارامترهای سنتیکی آنزیم

۴-۸-۲- بررسی نیم رخ دمای آنزیم

۴-۸-۳- بررسی نیم رخ pH آنزیم

۴-۸-۴- بررسی پایداری آنزیم در دماهای مختلف

۴-۸-۵- بررسی پایدای آنزیم در pH های مختلف

۴-۸-۶- بررسی اثر یون های فلزی بر فعالیت آنزیمی

۴-۸-۷- بررسی اثر حلال آلی

فصل پنجم بحث ونتیجه گیری