مقایسه و ارزیابی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP به سلول‌های یوکاریوتی توسط سازه‌های فاژی لامبدا و M13

ژن‌درمانی به عنوان روشی نوین برای درمان برخی بیماری‌های ژنتیک و سرطان، جایگاه ویژه‌ای را در عرصه پزشکی به خود اختصاص داده است. با این وجود موفقیت این روش درمانی الزامات گسترده‌ای دارد که ازآن جمله می‌توان به انتقال مؤثر ترانسژن، القاء بیان و کنترل میزان بیان در سلول هدف اشاره کرد. در میان گستره وسیعی از انواع ناقل‌های ژنی ویروسی و غیرویروسی، باکتریوفاژها به علت ویژگی‌های منحصر به فردی که دارند به عنوان حامل‌های ژنی بی‌خطر برای استفاده در بالین معرفی شده‌اند. دانشمندان تا کنون انواع متعددی از تحویل‌دهنده‌های ژنی مبتنی بر فاژ را طراحی نموده‌اند. در این میان دو فاژλ و M13 کارآیی به نسبت خوبی را در انتقال ژن از خود نشان داده‌اند. آنچه که در رابطه با این دو ناقل فاژی حائز اهیمت می‌باشد این است که سازه‌های فاژی مبتنی بر فاژهای λ و M13 به دلیل ساختار ژنومی متفاوتی که دارند انتظار می‌رود که کارآیی متفاوتی نیز در انتقال و بیان ترانسژن از خود نشان دهند. در این مطالعه ناقل‌های ژنیλ-ZAP-CMV و  pCMV Script حاوی ژن GFP به ترتیب به عنوان سازه‌های ژنی مبتنی بر فاژهای λ و M13 مورد استفاده قرار گرفتند. ابتدا ذرات فاژی -GFP λ  تکثیر شده و سپس از ذرات فاژی مذکور با روش برش و خارج‌سازی درون سلولی (In Vivo Excision) با کاربرد فاژ کمکی R408 ذرات فاژی M13-GFP تهیه شدند. ذرات فاژی حاصل پس از تأیید و تکثیر برای آلوده‌سازی سلول‌های AGS مورد استفاده قرار گرفتند و جهت تأیید ورود ذرات فاژی، سلول‌های تیمار شده توسط میکروسکوپ فلورسانس و نیز واکنش PCR مورد بررسی قرار گرفتند. در گام بعدی برای به دست آوردن سازه‌های فاژیλ-ZAP-CMV-GFP و نیز pCMV Script GFP، به ترتیب DNA ژنومی مربوط به ذرات فاژی -GFP λ و نیز M13-GFP تکثیر شده، استخراج و برای آلوده‌سازی سلول‌های AGS مورد استفاده قرار گرفتند. در نهایت کارآیی انتقال و بیان ژن GFP در سلول‌های AGS توسط دستگاه FACS مورد بررسی قرار گرفت.

نوع فایل :word

تعداد صفحات :۱۴۲

*———————————–*

۱-۱ مقدمه

۱-۲ ناقل‌های مورد استفاده در ژن‌درمانی

۱-۲-۱ ناقل‌های ژنی ویروسی

۱-۲-۲ ناقل‌های ژنی غیر ویروسی

۱-۲-۳ باکتریوفاژها

۱-۳ باکتریوفاژ لامبدا

۱-۳-۱ بیولوژی باکتریوفاژ لامبدا

۱-۳-۲ ساختار فاژ لامبدا

۱-۳-۳ سازماندهی ژنوم فاژ لامبدا

۱-۳-۴ چرخه زندگی فاژ لامبدا

۱-۳-۵ فاژ لامبدا به عنوان ناقل ژنی

۱-۴ باکتریوفاژ M13

۱-۴-۱ بیولوژی باکتریوفاژ M13

۱-۴-۲ ساختار باکتریوفاژ M13

۱-۴-۳ سازماندهی ژنومی باکتریوفاژ M13

۱-۴-۴ چرخه زندگی باکتریوفاژ M13

۱-۴-۵ فاژ M13 به عنوان ناقل ژنی

۱-۵ اهمیت و اهداف پژوهش

۲-۱ روش تهیه محلول‌ها و بافرها

۲-۱-۱ تهیه محلول ۱ مولار تریس

۲-۱-۲ تهیه کلرید کلسیم ۵۰ میلی‌مولار

۲-۱-۳ تهیه محلول EDTA 0.5 M  PH=8

۲-۱-۴ تهیه SDS10%

۲-۱-۵ تهیه بافر TE

۲-۱-۶ تهیه TBE 10X

۲-۱-۷ تهیه ژل آگارز %۱

۲-۱-۸ تهیه بافر SM

۲-۱-۹ تهیه PBS

۲-۱-۱۰ تهیه تریپسین- EDTA 0.25%

۲-۱-۱۱ تهیه پارافرمالدهید % ۴

۲-۱-۱۲ تهیه محلول سدیم آزید %۰۱/۰

۲-۲ تهیه محیط‌های کشت

۲-۲-۱ محیط کشت باکتری LB مایع

۲-۲-۲ محیط کشت LB مایع همراه با مکمل

۲-۲-۳ محیط کشت LB جامد

۲-۲-۴ تهیه محیط کشت NZY Agar:

۲-۲-۵ تهیه محیط NZY Top Agar:

۲-۲-۶ تهیه محیط ۲x YT

۲-۳ ناقل‌های مورد استفاده در پژوهش

۲-۳-۱ ناقل‌‌های فاژی Lambda ZAP®-CMV XR و pCMV Script Ex

۲-۴ باکتری‌های مورد استفاده در پژوهش

۲-۴-۱ باکتری E.coli  سویه XL1-Blue MRF´

۲-۴-۲ باکتری E.coli سویه XLOLR

۲-۵ کار با رده‌های سلولی

۲-۵-۱ ساخت محیط کشت

۲-۵-۲ افزودن سرم و تهیه محیط کشت کامل

۲-۵-۳ انجماد رده‌های سلولی

۲-۶ مراحل انجام پژوهش به صورت گام به گام

۲-۶-۱ کار با باکتریوفاژ لامبدا

۲-۶-۲ کار با باکتریوفاژ M13

۲-۶-۳ کشت و پاساژ رده‌ی سلول AGS

۲-۶-۴ ترانسفکشن سلول‌های AGS توسط ذرات فاژی M13-GFP

۲-۶-۵ استخراج فرم دورشته‌ای همانندساز سازه ژنی pCMV Script GFP

۲-۶-۶ محاسبه تعداد نسخه‌های سازه‌های فاژی λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP

۲-۶-۷ ترانسفکشن سلول‌های AGS توسط سازه‌های فاژی λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP

۲-۶-۸ بررسی ورود سازه‌های فاژی λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP به رده سلولی AGS

۳-۱ تأیید سازه ژنی λ-ZAP-CMV-GFP و ذرات فاژی λ-GFP

۳-۲ تکثیر ذرات فاژی λ-GFP و تعیین تیتر آن

۳-۳ ساخت ذرات فاژی M13 حاوی توالی GFP

۳-۳-۱ تأیید کلونی‌های حاوی سازه ژنی pCMV Script GFP

۳-۳-۲ تکثیر ذرات فاژی M13-GFP

۳-۳-۳ انتقال و بیان ژن GFP توسط ذرات فاژی M13-GFP

۳-۳-۴ بررسی ورود ذرات فاژی M13-GFP به سلول‌های AGS

۳-۳-۵ استخراج ssDNA از ذرات فاژی M13-GFP

۳-۳-۱ استخراج فرم دورشته‌ای همانندساز ناقل M13-GFP

۳-۴ استخراج λ-DNA

۳-۵ محاسبه تعداد نسخه‌های سازه‌های ژنی  λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP

۳-۶ ترانسفکشن سلول‌‌های AGS توسط سازه‌های استخراج شده از ذرات فاژی M13-GFP و

۳-۶-۱ بررسی بیان ژن GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس

۳-۶-۲ بررسی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP توسط دستگاه فلوسیتومتری

۳-۶-۳ بررسی شدت بیان ژن GFP در سلول‌های AGS

۴-۱ تهیه ذرات M13-GFP و بررسی کارآیی ترانسفکشن سلول های AGS توسط آنها

۴-۱-۱ بررسی انتقال و بیان ژن GFP توسط ذرات فاژی M13-GFP

۴-۱-۲ بررسی ورود ذرات فاژی M13-GFP به سلول‌های AGS

۴-۲ بررسی کارآیی انتقال و بیان ترانسژن توسط سازه‌های λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP

۴-۲-۱ بررسی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس

۴-۲-۲ بررسی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP به کمک تکنیک فلوسیتومتری

۴-۳ نتیجه‌گیری

۴-۴ پیشنهادات