جداسازی و تهیه تک کلون های القاء کننده پرحساسیتی دیررسDTH) )

فصل اول: کلیات

۱-۱ تعریف بیماری لیشمانیوز

۱-۱-۲ تاریخچه لیشمانیوز در جهان

۱-۱-۳ تاریخچه لیشمانیوز در ایران

۱-۲ رده­بندی و طبقه­بندی انگل لیشمانیا

۱-۳ مورفولوژی و سیر تکاملی انگل لیشمانیا

۱-۳-۱-۱ مورفولوژی انگل

۱-۳-۱-۲ شکل بی تاژک (آماستیگوت یا جسم لیشمن)

۱-۳-۱-۳ شکل تاژک دار (پروماستیگوت)

۱-۳-۲-۱ سیر تکاملی انگل

۱-۳-۲-۲ سیر تکاملی انگل در بدن حشره

۱-۳-۲-۳ پشه خاکی

۱-۳-۲-۴ سیر تکاملی انگل در بدن میزبان مهره دار

۱-۴  راههای انتقال لیشمانیا به انسان

۱-۴-۱ انتقال از طریق نیش پشه خاکی

۱-۴-۲  انتقال مکانیکی

۱-۴-۳ انتقال از راه خون

۱-۴-۴ انتقال مستقیم

۱-۵ بیماری­زایی لیشمانیا

۱-۵-۱ خصوصیات بیماری لیشمانیا

۱-۵-۲ لیشمانیوز احشایی

۱-۵-۳  لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)

۱-۵-۳-۱ لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن

۱-۵-۳-۲  لیشمانیوز جلدی خشک

۱-۵-۳-۳ لیشمانیوز جلدی مرطوب

۱-۵-۳-۴ لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)

۱-۵-۳-۴-۱ شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)

۱-۵-۳-۵  لیشمانیوز جلدی- مخاطی

۱-۶ ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا

۱-۶-۱  مشخصات ایمنولوژیکی در لیشمانیوز پوستی

۱-۶-۱-۱ نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال

۱-۶-۱-۲ نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی

۱-۶-۱-۳ عمل سلولهای نوتروفیل و ماکروفاژ در لیشمانیوز

۱-۶-۱-۳  عملکرد T-CELL

۱-۶-۲  مشخصات ایمنولوژیکی در لیشمانیوز احشایی

۱-۶-۲-۱ نقش ایمنی همورال در کالاآزار

۱-۶-۲-۳ نقش ایمنی سلولی در کالاآزار

۱-۶-۲-۴ .نقش مهم سلول های CD+4

۱-۷  روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز

۱-۷-۱ روشهای مستقیم تشخیص انگل

۱-۷-۱-۱ . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده

۱-۷-۱-۱ رنگ آمیزی

۱-۷-۱-۲ کشت انگل

۱-۷-۲  روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل

۱-۷-۲-۱ آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال

۱-۷-۲-۲ آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی

۱-۷-۲-۲-۱ تستهای پوستی

۱-۷-۲-۳ ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)

۱-۷-۳ آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو

۱-۷-۳-۱ معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی

۱-۷-۴ تست سنجش تکثیر لنفوسیتی  ymphocyte proliferation test(L.T.T)

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

فصل سوم: مواد و روشها

۳-۱کشت انگل

۳ -۱-۱  مواد مورد نیاز جهت کشت انگل

۳-۱-۲٫ وسایل مورد نیاز جهت کشت انگل

۳-۱-۳٫ طرز تهیه محیط کشت مایع RPMI- 1640‌

۳-۱-۴٫ طرز تهیه محیط کشت کامل

۳-۱-۵٫ طرز تهیه محیط کشت NNN

۳-۱-۶٫ طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline

۳-۱-۷٫ روش کشت انگل

۳-۱-۸٫ روش شمارش سلولها

۳-۱-۸-۱٫ مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل

۳-۱-۸-۲٫ شمارش با لام نئوبار

۳-۲٫ جداسازی انگلها با limiting dilution assay

۳-۲-۱٫ مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay

۳-۲-۲٫ مراحل Limiting dilution assay

۳-۳٫ تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی

۳-۳-۱٫ مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو

۳-۴ تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها

۳-۵ الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )

۳-۵-۱ اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید

۳-۵-۲ سیستم بافری

۳-۵-۳  مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE

۳-۵-۴ آماده­سازی نمونه

۳-۵-۶ طرز تهیه بافر الکترود

۳-۵-۷٫ روش انجام SDS-PAGE

۳-۵-۸ روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250

مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:

۳-۶ سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay

۳-۶-۱ مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford

۳-۶- ۲ روش کار سنجش پروتئین تام

۳-۷ تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)

۳-۷-۱ روش انجام تست L.T.T

۱-۳-۷-۱٫ مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T

۳-۸ ایمنی­زایی در خوکچه هندی

۳-۸-۱ مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی

۳-۸-۲  نحوه ایمنی­زایی در خوکچه

۳-۹ تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH

۳-۹-۱ مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH

۳-۹-۲  مراحل تزریق داخل پوستی

۳-۹-۳  نحوه سنجش میزان DTH

فصل چهارم: نتایج

۴-۱ کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution

۴-۲  بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها

۴-۳ نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford

۴-۴ بررسی نتایج تست L.T.T

۴-۴-۱  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B

۴-۴-۲  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C

۴-۴-۳٫  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D

۴-۴-۴ نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)

۴-۴-۵٫  بررسی نتایج حاصل  از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A

۴-۴-۶ بررسی نتایج کلی L.T.T

۴-۵ بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی

۴-۵-۱  نتایج تست DTH 24 ساعته

۴-۵-۲ نتایج تست DTH 48 ساعته

۴-۵-۳ نتایج تست DTH 72 ساعته

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

منابع