مقایسه ی میزان وقوع آپوپتوزدر بافت بیضه ی موش نابالغ پس از استفاده از دو روش انجماد شیشه ای متفاوت

فصل اول: مقدمه

۱-۱-مقدمه

۱-۲-انجماد

۱-۲-۱-تاریخچه ی انجماد

۱-۲-۲-تکنیک های مختلف انجمادی

۱-۲-۲-۱-انجماد آهسته

۱-۲-۲-۲-انجماد شیشه ای

۱-۲-۳-محلول های انجمادی

۱-۲-۳-۱-ضدیخ ها

۱-۲-۳-۲-سرم

۱-۲-۴-تاثیرات انجماد بر بافت بیضه

۳- ۱-۳-پیوند

۴- ۱-۴-کشت

۵- ۱-۵-تغییرات ملکولی متاثر از انجماد

۱-۵-۱-آپوپتوزیس

۱-۵-۱-۱-مسیر خارجی آپوپتوز و ژن های دخیل در آن

۱-۵-۱-۲-مسیرداخلی آپوپتوز و ژنهای دخیل در آن

۱-۵-۱-۳-P53

۱-۵-۱-۴-کاسپاز ۳

۱-۶-هدف

۱-۷-پرسش پژوهشی

۱-۸-فرضیات

فصل دوم : مواد و روش ها

۲-۱-تهیه ی بافت بیضه و گروه های مورد مطالعه

۲-۲-انجماد شیشه ای بافت بیضه

۲-۲-۱-روش تهیه محیط پایه

۲-۲-۲-روش تهیه محلول های انجماد شیشه ای

۲-۲-۲-۱-روش آماده سازی محلول انجمادی I

۲-۲-۲-۲-روش آماده سازی محلول انجمادی II

۲-۲-۳-مراحل انجماد شیشه ای

۲-۲-۳-۱-روش انجمادی I

۲-۲-۳-۲-روش انجمادی II

۲-۲-۴-ذوب بافت بیضه

۲-۲-۴-۱-روش تهیه محلول های ذوب

۲-۲-۴-۲-مراحل ذوب

۲-۵-مطالعات میکروسکوپی و بافت شناسی بافت بیضه

۲-۶-بررسی آپوپتوز و بقا سلولی

۲-۶-۱-هضم مکانیکی و آنزیمی بافت بیضه

۲-۶-۱-۱-هضم مکانیکی

۲-۶-۱-۲-هضم آنزیمی

۲-۶-۱-۳-خنثی سازی اثر آنزیم و بررسی بقا با استفاده از رنگ PI

۲-۶-۲-ارزیابی بقای سلولی به روش فلوسایتومتری

۲-۶-۳-بررسی آپوپتوز سلولی

۲ -۷-کشت بافت بیضه

۲-۷-۱-آماده سازی آگار

۲-۷-۲-آماده سازی محیط کشت

۲-۷-۲-۱-روش تهیه محیط RPMI

۲-۷-۳-کشت بافت بیضه

۲-۸-ارزیابی ژن های آپوپتوزی

۲-۸-۱-نگهداری بافت در محلول RNA-later

۲-۸-۲-استخراج RNA با استفاده از ترایزول

۲-۸-۲-۱-هموژن کردن بافت

۲-۸-۲-۲-مرحله ی جداسازی

۲-۸-۲-۳-رسوب RNA

۲-۸-۲-۴-شستشو RNA

۲-۸-۳-بررسی کیفی RNA های استخراج شده

۲-۸-۴-تیمار نمونه­یRNA  با استفاده از DNase1 جهت حذف آلودگی ژنومی

۲-۸-۵-سنتز cDNA

۲-۸-۶-پرایمر

۲-۸-۶-۱-آماده سازی پرایمرها

۲-۸-۶-۲-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها

۲-۸-۷-الکتروفورز

۲-۸-۷-۱-روش ساخت بافر۵۰X TAE

۲-۸-۷-۲-روش ساخت بافر X TAE1

۲-۸-۷-۳-طرز تهیه ی ژل آگارز

۲-۸-۷-۴-بررسی آلودگی پرایمر

-۸-۷-۴-بررسی کیفیت RNA

۲-۸-۸-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر

۲-۸-۹ Real-Time PCR

۲-۸-۹-۲-بررسی کمی بیان ژن با استفاده از روش Real-Time PCR

۲-۹-آنالیز آماری داده

فصل سوم: نتایج

۳-۱-بررسی مورفولوژی بافت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین

۳-۲-مقایسه بقای سلولی در گروه کنترل با گروه های انجمادی I و II بلافاصله پس از ذوب

۳-۳-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه

۳-۳-۱-ارزیابی میزان بقای سلولی طی کشت بافت بیضه

۳-۳-۲-آپوپتوز اولیه ی سلولی طی کشت بافت بیضه

۳-۳-۳-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه

۳-۳-۴-نکروز بافتی طی کشت بافت بیضه

۳-۴-بررسی بیان ژن های آپوپتوزی در سطح رونوشت

۳-۴-۱-بررسی بیان رونوشت ژن های دخیل در مسیر های آپوپتوزی

۳-۴-۲-Bax

۳-۴-۳-BCL2

۳-۴-۴-نسبت بیان BAX به BCL2

۳-۴-۵-Caspase3

۳-۴-۶-Fas

۳-۴-۷-Fas Ligand

۳-۴-۸-P53

۲۷- فصل چهارم: بحث

۴-۱-کلیات

۴-۲-بررسی های مورفولوژیک در ساعات مختلف کشت در گروه های مورد مطالعه

۴-۳-بررسی بقا و آپوپتوز سلولی در گروه های مورد مطالعه

۴-۴-بررسی بیان ژن های مرتبط با وقوع آپوپتوز در گروه های مورد مطالعه

۴-۵-نتیجه گیری

۴-۶-پیشنهادات