بیان وتخلیص پروتئین نوترکیب DR2418 داینوکوکوس رادیودورانس در اشریشیا کلی

زمینه و اهداف: داینوکوکوس رادیودورانس یکی از میکروارگانیسم های مقاوم به پرتو است و می تواند در محیط های خشن به حیات خود ادامه دهد. مطالعات نشان می دهد که چندین پروتئین آنتی اکسیدان و ترمیم کننده DNA در مقاومت بخشی به پرتو نقش دارد. پروتئین DR2418 یکی از پروتئین های تنظیمی مهم در داینوکوکوس رادیودورانس در مقاومت بخشی به پرتو است. هدف از این مطالعه کلونینگ و بیان ژن dr2418 در E. coli و تخلیص پروتئین این ژن می باشد.روش کار: ژن dr2418 داینوکوکوس رادیودورانس بصورت سنتتیک در وکتور pGEM-B1 ساخته شد و به دنبال آن ژن dr2418 در وکتور بیانی pET21a ساب کلون شد. صحت ساب کلونینگ توسط هضم آنزیمی و توالی یابی تایید شد. ژن dr2418 در E. coli بیان شد و پروتئین نوترکیب DR2418 توسط ژل الکتروفورز پلی اکریل آمید و وسترن بلاتینگ تایید شد.همچنین با استفاده از ستون کروماتوگرافی جذبی این پروتئین تخلیص گردید.نتایج: پلاسمید pET21a حاوی ژن dr2418 به همراه برچسب هسیتیدینی در قسمت C-ترمینال بطور موفقیت آمیز ساخته شد. هم چنین، پروتئین نوترکیب DR2418بصورت داخل سلولی در E. coli ترانسفورم شده تولید ، و تخلیص آن با موفقیت انجام شد.

نوع فایل :word

تعداد صفحات :۱۱۰

*———————————–*

فصل اول : مقدمه و کلیات

فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام شده

۲-۱-   ترمیم شکستگیهای DNA دورشتهای:

۲-۲-   مکانیسم ترمیم شکستگی DNA دورشته ای:

۲-۲-۲-   اتصال تک رشته (SSA):

۲-۲-۳-   سنتز Extended وابسته به اتصال رشته ها (ESDSA):

۲-۳-   ساختار نوکلئوتید

۲-۴-   پاسخ سلول های داینوکوکوس متعاقب اشعه گاما:

۲-۵-   ژن های دخیل در مقاومت بخشی به اشعه:

۲-۶-   منابع میکروبی مقاوم به پرتو فرابنفش و پیامدهای درمانی:

۲-۷-   فواید اکستریموفیلهای مقاوم در برابر تابش

۲-۷-۱-   پیامدهای دارویی اکستریمولیت های مقاوم در برابر تابش

۲-۷-۲-   پیامدهای بیوتکنولوژیکی اکستریمولیت های مقاوم در برابر اشعه

۲-۸-   محدودیتها و چالشها در دیدگاه پنج ساله

فصل سوم : مواد و روشها

۳-۱-   آماده سازی وکتور pGEM-B1 حاوی ژن سنتتیکdr2418-opti

۳-۲-   مستعدسازی E.coli DH5a

۳-۳-   تراریختی یا انتقال وکتور حاوی ژن سنتتیک به درون سلول مستعد E.coli DH5a

۳-۳-۱-   استخراج پلاسمید pGEM-B1 حاوی ژن سنتتیک dr2418-opti

۳-۳-۲-   تایید استخراج پلاسمید حاوی ژن سنتتیک با روش آگارز ژل الکتروفورز

۳-۳-۳-   آماده سازی نمونهها برای الکتروفورز

۳-۳-۴-   رنگ آمیزی DNA در ژل آگارز

۳-۳-۵-   تهیه بافر TBE(10X)

۳-۳-۶-   طرز تهیه ژل آگارز

۳-۳-۷-   هضم آنزیمی وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزیم NdeI

۳-۳-۸-   هضم آنزیمی وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزیم BamHI

۳-۳-۹-   تخلیص ژن سنتتیک dr2418 از روی ژل

۳-۳-۱۰-   برش پلاسمید pET-21a توسط آنزیم NdeI

۳-۳-۱۱-   برش وکتور pET-21a (هضم شده با NdeI) توسط BamHI

۳-۳-۱۲-   لیگاسیون وکتور  pET-21a و ژن سنتتیک dr2418

۳-۳-۱۳-   ترنسفورماسیون pET/ dr2418 در سلول مستعد DH5a

۳-۴-   توالییابی ژن سنتتیک در  pET-21a

۳-۵-   القاء ساختارهای بیانی pET21a-dr2418 توسط IPTG به منظور تولید پروتئین DR2418 دارای برچسب هیستیدین (His-tagged r-dR2418):

۳-۶-   ارزیابی پروتئین DR2418 تولید شده به وسیله الکتروفورز در ژل پلی آکریلامید (SDS-PAGE)

۳-۷-   یکسان سازی غلظت کلی پروتئینها در نمونه های قبل و بعد از القا جهت انجام SDS-PAGE

۳-۸-   شناسائی و تائید پروتئین His-tagged r-DR2418 با روش Western blot

۳-۹-   نگهداری و ذخیره باکتریهای مولد پروتئین ِDR2418:

۳-۱۰-   بررسی پایداری پلاسمیدها (Plasmid stability Test)

۳-۱۱-   خالصسازی پروتئین نوترکیب DR2418 به روش کروماتوگرافی

۳-۱۱-۱-    لیز سلولی باکتری E.coli

۳-۱۱-۲-   آماده کردن ستون

۳-۱۱-۳-   تزریق نمونه و شستشو

۳-۱۱-۴-    جدا سازی یپروتئین نوترکیب

۳-۱۱-۴-۱-   روش دیالیز

۳-۱۱-۵-۱-  رسم منحنی استاندارد

۳-۱۱-۵-۲-  تهیۀ محلول برادفورد

۳-۱۱-۶-    بازیافت و نگهداری ستون

فصل چهارم : نتایج

۴-۱-   غربال کردن کلنی های حاوی pGEM-B1 دارای قطعه DR2418:

۴-۲-   غربال کردن کلنیهای E. coli DH5 حاوی pGEM-B1 دارای قطعه

۴-۲-۱-   تایید پلاسمیدهای استخداج شده با برش آنزیمی NdeI:

۴-۲-۲-   تایید پلاسمیدهای خطی شده حاوی ژن سنتتیک با هضم آنزیمی BamHI:

۴-۳-   جداسازی قطعه از روی ژل و فرایند Ligation:

۴-۳-۱-   تایید صحت واکنش Ligation ژن در وکتور با روش تعیین توالی:

۴-۴-   ترانفسفورم وکتور pET21a حاوی ژن dr2418 به سلول E. coli Origami و ارزیابی بیان پروتئین DR2418:

۴-۵-   شناسائی و تائید پروتئین DR2418 با روش Western Blot Wet transfer))

۴-۶-    بیان ژن dr2418 در حجم یک لیتر محیط کشت

۴-۷- برسی تخلیص پروتئین بر روی ژل SDS_PAGE:

۴-۸-  نتایج سنجش غلظت پروتئین:

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری

ضمیمه:

پیشنهادات: