بهینه سازی فرآیند تولید پروتئینهای نوترکیب در سیستم بیان موقت

بیماری عروق کرونر قلب یکی از شایع ترین بیماری ها در سطح جهان به خصوص کشور های صنعتی می باشد.فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی (t-PA( Tissue Plasminogen Activator، یک پپتید طبیعی است که با اتصال به فیبرین موجود در لخته و تبدیل پلاسمینوژن به پلاسمین باعث شکسته شدن فیبرین، فیبرینوژن و سایر پروتئین‌های انعقادی شده و  با رفع انسداد باعث به حداقل رساندن آسیب بافتی و در نهایت نجات بیمار می‌شود. پروتئین مورد بررسی در این مطالعه فرم کوتاه شده موتانت از داروی t-PA باخواص فارماکولوژیک بهینه می باشد که در میزبان بیانی CHO(Chinese Hamster Ovary) با هدف تغییرات پس ترجمه ای مناسب و مشابه فرم طبیعی بیان می شود.بیان موقت پروتئین(Transient Gene Expression) TGE روش رایجی برای بیان پروتئین های نو ترکیب در بازه زمانی کوتاه و در مقیاس مناسب جهت انجام تست های پیش بالینی Preclinical)) می باشد.در این مطالعه از این روش و بهینه سازی آن برای تولید پروتئین نوترکیب t-PA استفاده شد و مقادیر بهینه شده برای میزان cell  DNA10⁶/µg2 وبرای عامل انتقال ژن Transfection reagent)) cell  ۱۰^۶/µg5/1 و میزان سلول مورد استفاده ۱۰^۵×۵ سلول معین گردید.همچنین با دیدگاه Scale-up در بیوپروسه و اثر استراتژی های تغذیه ای با عوامل پپتونی مختلف بر میزان بیان و رشد پروتئین و تغییر رفتار متابولیک آن بررسی گردید.به منظور بهینه سازی بیان فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی (t-PA)در سلول CHO  در این فرایند از ۶ پپتون با منشا گیاهی(Soy,Casein) مختلف استفاده گردید .آنالیز نتایج نشان داد که چگونگی تاثیر پپتون ها بر روی بیان ژن مورد نظر در سلول CHO در تعدادی از پپتون ها از الگوی خاصی تبعیت می کند.در برخی موارد اثر مثبت و در موارد خاصی تاثیر منفی داشته است , که احتمالا این تاثیرات ناشی از ماهیت ترکیب آمینو اسیدی پپتون های به کار رفته می باشد. همچنین استفاده از این ترکیبات پپتونی در محیط کشت سلول ترانسفکت شده علاوه بر افزایش بیان پروتئین  می تواند سبب کاهش تولید متابولیت های نامطلوب نیز شود.

نوع فایل :word

تعداد صفحات :۱۳۰

*———————————–*

مقدمه

۱-۱)اهمیت پروتئینهای نوترکیب -جایگاه جهانی و درمانی

۱-۲)بیماری های قلبی عروقی

۱-۳)پاتوفیزیولوژی ترومبوآمبولی

۱-۳-۱)سکته مغزی

۱-۳-۲)ترومبوآمبولی عروق عمقی اندام ها

۱-۴) مسیر انعقاد

۱-۵) فیبرینولیز

۱-۶) درمان

۱-۷) داروهای ترومبولیتیک

۱-۸)جنبه های اقتصادی

۱-۹) تاریخچه داروهای ترومبولیتیک

۱-۱۰)روش های مقابله با ترومبوآمبولی

۱-۱۱)تجزیه لخته های فیبرینی

۱-۱۲)مهار کننده های t-PA

۱-۱۲-۱) ۲   α آنتی پلاسمین

۱-۱۲-۲) ۲ α ماکروگلوبین

۱-۱۲-۳) TAF-I)) Thrombin Activable Fibrinogen Inhibitor

۱-۱۳)سنتز t-PA

۱-۱۴)میل الحاقی به فیبرین

۱-۱۵)غلظت-فعالیت و نیمه عمر

۱-۱۶)ساختار دومن ها

۱-۱۷)تاریخچه درمان تجزیه لخته

۱-۱۸)داروهای تجزیه کننده فیبرین

۱-۱۹)طبقه‌بندی داروهای ترومبولیتیک

۱-۲۰)انواع فعال کننده های  پلاسمینوژن

۱-۲۰-۱) Streptokinase

۱-۲۰-۲) Urokinase

۱-۲۰-۳) Staphylokinase

۱-۲۰-۴) Alteplase

۱-۲۰-۵) Reteplase

۱-۲۰-۶) Tenecteplase

۱-۲۰-۷) Lanoteplase

۱-۲۱) Truncated t-PA

۱-۲۰-۸) میزبان های رایج در تولید پروتئین های نوترکیب

۱-۲۱)انتخاب رده سلولی مناسب

۱-۲۲)رده های  سلولی رایج  در بیان پروتئین های نوترکیب

۱-۲۳)مزایای CHO

۱-۲۴)روش های بیان ژن

۱-۲۴-۱)سیستم بیان پایدار ژن Transient Gene Expression))

۱-۲۴-۲)سیستم بیان موقت ژن Transient gene expression))

۱-۲۵)روش های انتقال ژن به سلول های پستانداران

۱-۲۵-۱)روشهای انتقال ژن غیر ویروسی

۱-۲۶)فاکتور های دخیل در کشت سلول های نوترکیب

۱-۲۷)انواع سلول ها از نظر نحوه کشت

۱-۲۷-۱)سلول های غیر وابسته به بستر

۱-۲۷-۲)سلول‌های وابسته به بستر

۱-۲۸) کشت معلق

۱-۲۹)انتخاب محیط کشت مناسب و شرایط محیط کشت

۱-۳۰)بهینه سازی شرایط کشت سلول

۱-۳۱)متابولیسم سلولی و تولید متابولیت های سلولی

۱-۳۱-۱)نقش گلوکز در محیط کشت

۱-۳۲)عناصر تشکیل دهنده محیط کشت

۱-۳۲-۱)عناصر ماکرو

۱-۳۲-۲)عناصر میکرو

۱-۳۲-۳)نقش عناصر میکرو در محیط کشت

۱-۳۲-۴)ویتامین ها

۱-۳۲-۵) Pluronic acid

۱-۳۳)نقش گلوتامین در محیط کشت

مواد و روش ها

۲-۱)دستگاه های مورد نیاز

۲-۲) میکروارگانیسم ها و سلول های مورد استفاده

۲-۳)لیست کامل مواد استفاده شده

۲-۴) لیست کامل وسایل مورد استفاده

۲-۵) شرایط لازم جهت انجام کشت سلول rCHO DG44

۲-۵-۱)محیط های کشت جهت فرایند بهینه سازی

۲-۵-۱-۱)تهیه محیط کشت BRC

۲-۵-۱-۲)ذخیره سازی سلول ها و محیط های کشت

۲-۶)آماده سازی سلول هایrCHO DG44

۲-۷) دفریز نمودن سلولهایrCHO DG44

۲-۸) انکوباسیون سلول هایrCHO DG44

۲-۸-۱)انکوباتور دی اکسید کربن

۲-۸-۲)دمای انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44

۲-۸-۳) میزان co2 انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44

۲-۸-۴) رطوبت انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44

۲-۹) استریلیزاسیون انکوباتور

۲-۱۰)  آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها

۲-۱۰-۱) میزان مصرف آنتی بیوتیک

۲-۱۱) کشت سلول های rCHO DG44

۲-۱۲)ارزیابی وضعیت محیط کشت از نظر pH

۲-۱۳) شمارش سلول های rCHO DG44

۲-۱۳-۱)اصول شمارش سلول

۲-۱۳-۲)تعیین درصد سلول های زنده Viability))

۲-۱۳-۳) انجماد سلولها و ذخیره سازی آنها  Cell Freezing))

۲-۱۴)ترانسفکشن سلول rCHO DG44

۲-۱۴-۱)پلاسمید حاوی ژن

۲-۱۴-۲)تهیه DNA‌

۲-۱۴-۳)کشت سلول

۲-۱۵)بهینه سازی فرایند TGE

۲-۱۵-۱)ترانسفکشن به روش PEI

۲-۱۵-۲)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE

۲-۱۵-۳)بررسی میزان بهینه DNA جهت انجام TGE

۲-۱۵-۴)اندازه گیری میزان درصد ترانسفکشن

۲-۱۵-۴-۱)اندازه گیری GFP به روش فلوسایتومتری

۲-۱۶)افزودن  غلظت های متفاوت پپتون های گیاهی به محیط های کشت

۲-۱۶-۱) تعیین پروفایل رشد

۲-۱۶-۲)تعیین پروفایل بیان به روش  Elisa

۲-۱۶-۲) بررسی تغییرات رفتار متابولیک سلول ها

نتایج

۳-۱)ترانسفکشن سلول های rCHO DG44 به روش TGE

۳-۱-۱)بررسی میزان بهینه PEI جهت انجام TGE

۳-۱-۲)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE

۳-۱-۳)بررسی میزان بهینه  DNAجهت انجام TGE

۳-۲)تعیین الگوی رشد سلول های CH0 DG44 در محیط های کشت  ProCHO 5,CD DG44و BRC

۳-۳)غلظت پپتون ها وابسته به نوع محیط کشت

۳-۴)بررسی تغییرات متابولیکی در سلول های CHO DG44 تولید کننده t-PA

۳-۴-۱)بررسی تغییرات متابولیکی در محیط ProCHO 5

۳-۴-۲)تغییرات متابولیکی در محیط CD DG44

۳-۴-۳)  بررسی تغییرات متابولیکی در محیط BRC CD

۳-۵)بررسی تاثیر پپتون ها بر میزان بیان پروتئین نوترکیب

۳-۶)بررسی تاثیر  استراتژی تغذیه با پپتون های گیاهی در بهینه سازی TGE

بحث و نتیجه گیری نهایی